真人性交图片 甾类化合物微生物飞舞与领悟代谢机制究诘进展
发布日期：2024-10-31 04:22 点击次数：180
甾类化合物在医药界限的阛阓需求仅次于抗生素，大师总产值已达400亿元，有400多种授权甾类药物在流畅，何况将来的需求还会递加[1-3]。甾类化合物是进击的人命元素，是组成甾醇(Sterols)、胆汁酸(Bile acid)、维生素D (Vitamin D)、神经甾体(Neurosteroids)以及类固醇激素(Steroid hormones)的基本结构物资真人性交图片，具有进击的生理医药功能[3-4]。甾体药物大多是利器具有甾体骨架的自然家具进行结构纠正及化学合成而成，甾体药物行动进击的激素药物对机体起着进击的调治作用，被开发成为麻醉药、抗心律失常药、抗细菌药、抗胆碱酯酶药、抗凝血剂、抗真菌药、抗肿瘤药、抗原天真物药、胆汁分泌剂、会诊剂、神经调治阻断剂、胆石分散剂、止血剂、钙调治剂、脂调治剂、精神病调节剂、泻药与安谧药等[5]。甾类药物起初是从动物肾上腺索求的，昭着施行应宅心旨并不大。自后也有究诘者尝试以有机小分子为原料开赴通过化学行动全合成工艺的探索，固然表面上可行，关联词由于合成道路太长、收率低、响应性差且副家具处治贫瘠，加之环境混浊问题，严重费劲工业坐褥应用价值[2, 6-7]。
甾体药物的工业化坐褥主要有化学合成法和微生物飞舞法两种。以植物体中索求的薯蓣皂素(Diosgenin)、剑麻皂素(Tigogenin)、蕃麻皂素(Hecogenin)等皂素为主导原料，进一步借助化学行动合成甾药要津中间体的工艺靠近坐褥本钱高、神气较多、历程复杂以及环境混浊严重等客不雅问题[8-11]。1970年薯蓣皂苷元过火它皂苷元细腻被开采为甾醇药物合成的肇端物资，关联词由于供应量的减少和价钱的攀升导致该工艺的利润有所下落，且1992年纠合国卫生组织文书不容使用全化学合成法坐褥药物，已渐渐不适用甾醇工业化坐褥[12]。而微生物飞舞(Microbial transformation)是指讹诈微生物产生的酶作用于化合物的某一基团，使其飞舞为结构上雷同且更有价值的新式家具，其响应骨子为酶促响应，具有较强的专一性与手性采选性，不错弥补化学合成的不及。1908年Bondi究诘了胆酸代谢蹊径以及各式分枝杆菌领悟氧化甾醇类化合物，1913年Sohngen发现多种微生物偶然以甾醇为惟一碳源滋长，1952年Murray与Petersons初度讹诈黑根霉一步催化黄体酮为11α-羟基黄体酮，创始了微生物飞舞甾体化合物的前例。1944年第一次发现分枝杆菌不错降解胆固醇飞舞为4-雄烯二酮(4-Androstene-3, 17-dione，4-AD)与1, 4-雄烯二酮(Androsta-1, 4-diene-3, 17-dione，ADD)，究诘者接踵发现更多不同微生物不错降解不同甾醇类化合物制备甾药要津中间体如4-AD或ADD，而4-AD或ADD是甾类激素药物不可替代的中间体，实在不错用于合成统统的甾类激素药物，因此以植物甾醇(Phytosterols)为原料讹诈微生物降解而制备要津中间体工艺，相对于以皂素为原料的化学合成工艺因具有原料起头安稳、无混浊以及本钱低的优点而被接收。关联词，微生物降解甾类化合物的领悟代谢机制仍有待进一步深切探索，何况不同的微生物间还存在一定的互异性。本文先容了微生物飞舞甾类化合物过火领悟代谢机制方面的究诘进展，为进一步究诘代谢分子机制及坐褥应用提供一定参考。
1 甾类化合物的结构种类及主要起头甾体类化合物属于脂类，频繁指一类独特的多元环萜类化合物，包括核心环(Core ring)、C17位侧链(Side chain)以及不同官能团取代基(Functional groups)三部分，核心环(Core ring)由A、B、C三个完竣紧闭的六元环和一个五元环D环组成，C17位侧链频繁为长烃类，包括8个碳链烷基、10个碳烷基或者烯基等，官能团取代基主要指核心环碳原子相连的相关的官能团，常见位点有C3、C9、C11、C17、C18、C19等。字据核心环特色频繁包括五类基本结构单元(图 1A)，即Cholest、Chol、Pregn、Androst、Estr等单元，其余的均为相应结构单元的养殖物结构。频繁所说的甾醇类物资结构特色为C3位β-OH、C17位为8–10个碳链烷基或者烯基，C10位与C13位连有甲基，如胆固醇(Cholesterol) (图 1B)。甾类化合物领有雷同的结构且结构复杂数量闹热，在当然界中存在上千种甾类化合物，宽阔存在于动植物和部分微生物中[1, 13-16]，胆固醇(Cholesterol)、性激素(Sex hormones)、肾上腺皮质激素(Adrenocortical hormones)、胆汁酸(Bile acids)、维生素D (Vitamin D)及神经甾体(Neurosteroids)等存在于高档脊椎动物体中，腐朽类固醇(Ecdysteroids)存在于虫豸体内，麦角固醇(Ergosterol)存在于酵母细胞壁中，β-谷甾醇(β-Sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、菜油甾醇(Campesterol)、岩藻甾醇(Fucosterol)、菜籽甾醇(Brassicasterol)等(图 1B)存在于植物中。其中植物甾醇(Phytosterols，PSs)多达250种以上[1]，由于植物甾醇起头等闲且价钱相对低廉，因此用于坐褥进击的医药甾药化合物或中间体(图 1C)。
2 甾类化合物的生理功能对于甾体药物的作用机理，大多比拟认同的是“基因抒发学说”，即由于甾体激素分子量小(300 Da掌握)且脂溶性强，因此很容易透过细胞膜干与细胞内，起初与胞浆受体联结酿成复合物，然后穿过细胞核膜与核内受体联结，进而初始或遏制DNA的复制转录，最终引导或遏制新卵白的生成，从而引起各式生感性状的篡改[4, 7, 17]。甾体化合物的生理功能取决于核心环相连的官能团的种类、数量以及位置的构型[1, 18]。甾体化合物主要包括胆固醇、植物甾醇、胆汁酸、维生素D、神经甾体与类固醇激素等。胆固醇是组成细胞壁膜的因素之一，主要分散在磷脂双分子层之间，不错影响细胞膜的流动性以及调治细胞增殖与分化[19]，主要生理功能体现时参与血浆卵白的合成，在体内可飞舞为胆汁酸盐、维生素D3前体以及肾上腺皮质激素与性激素等(图 1D)。植物甾醇在食物中行动添加剂以及在化妆品中也有进击的应用[3, 13, 20-21]。尤其是植物甾醇中的豆甾醇不错防止胆固醇的接纳，从而镌汰血清中胆固醇的含量，具有抗氧化活性，防御和调节高血压、冠心病等心血管疾病，能促进血纤维卵白溶酶的激素因子，不错防御血栓症，此外还不错遏制癌细胞的酿成。胆汁酸是组成胆汁的进击因素，在胆汁中主要以甘氨酸胆甾酸和牛磺酸胆甾酸的钠盐或钾盐的神态存在，减少水与脂肪的名义张力，促进脂溶性维生素的接纳与脂肪的消化，具有调治糖代谢与能量代谢、抗炎症、药物代谢与脱毒的功效[15, 22]。维生素D是一类具有抗伛偻病价值的维生素，对骨骼的酿成有着进击的意旨。神经甾体专指神经系统产生的甾体化合物，主要通过干与突触缺陷调治GABAA (γ-氨基丁酸A型)受体的功能而影响神经细胞的忻悦性，对核心神经系统有着等闲的生理作用，具有保护伞经细胞、悠闲催眠、麻醉、抗惊厥、抗慌张、促进学习悲伤和改善阐明才智等作用，而莫得神经毒性和传统甾体激素的反作用[23]。究诘标明，去氢表雄酮(Dihydroepiandrosterone，DHEA)不错告成作用于神经元细胞名义，篡改神经递质受体结构，从而调治神经刺激在细胞间的传递[1, 23-25]。
甾体激素又称类固醇激素，字据生理学功能分为肾上腺皮质激素和性激素，其中肾上腺皮质激素分为糖皮质激素(Glucocorticoids)和盐皮质激素(Mineralocorticoids)，而性激素包括孕激素(Progestogens)、雌性激素(Estrogens)、雄性激素(Androgens)以及卵白同化激素类(Anabolic steroids)。肾上腺皮质激素基本结构中甾体母核含有21个碳，C3位与C20位均为羰基，C4-5为双键。糖皮质激素在C17位有α-羟基以及C11位为羟基(如氢化可的松)或者羰基(如可的松)，是机体应激响应最进击的调治激素，参与调治糖类、脂肪与卵白质代谢，调治机体发育滋长以及免疫功能等，具有抗炎、抗毒、抗过敏、抗休克、非特异性遏制免疫及退热等多种作用，亦然临床上使用最等闲而有用的抗炎和免疫遏制剂，而盐皮质激素在C17位无α-羟基与C11位无氧(如去氧皮质酮)或者在C11位有氧但与C18位碳联结(如醛固酮)，主要生理作用是促进肾小管重接纳钠而保留水比肩泄钾，与下丘脑分泌的抗利尿激素相互谐和，共同守护机体电解质均衡和体液容量[5, 7, 23]。孕激素基本结构中母核含有21个碳，C3位为羰基，C4-5为双键，C17位为β-甲基酮，主要生理作用是促进女性附性器官熟悉考中二性征出现，并守护普通性欲及生殖功能的激素[26]。雌性激素基本结构中母核含有18个碳，A环为苯环结构，C3位为羟基，C17位为β-羟基，主要生理作用是促进雌性第二性征的发育和性器官的熟悉，促进卵白质合成，减少碳水化合物讹诈，调治水、盐分子与钙的均衡，与孕激素悉数完成性周期、妊娠、哺乳等，用于调节女性性功能疾病、更年期概括症、骨质疏松症等[4, 7]。雄性激素基本结构中母核含有19个碳，C3位为羰基，C4-5为双键，C17位为β-羟基，主要生理功能是促进男性器官及副性征的发育和熟悉，扞拒雌激素，遏制子宫内膜滋长及垂体-性腺功能，增强免疫功能，促进卵白质合成及骨质酿成，刺激骨髓造血功能，使红细胞和血状红细胞增多[7]。卵白同化激素是由雄性激造就殖出的一系列东谈主工合成类固醇化合物，是一类外源性的以卵白同化作用为主的甾体激素，可分为睾酮养殖物、雄烷养殖物、诺龙养殖物、杂环养殖物以及杂类合成类固醇，主要生理功能为雄性化作用显赫悠闲而卵白同化作用增强，促进卵白质合成和遏制卵白质异化，促进组织钙化和滋长，刺激骨髓造血功能，增多红血球量，促进组织更生和肉芽酿成，镌汰胆固醇[5, 7, 18]。因此，开发甾类药物对改善东谈主类健康体质显得尤为进击，具有十分进击的社会意旨。
3 甾类化合物微生物飞舞与领悟代谢机制 3.1 甾类化合物飞舞微生物甾体微生物飞舞是讹诈微生物细胞酶系对甾体化合物某一特定部位进行化学响应产生新的家具。微生物对甾类化合物好多位置的原子或基团齐有可能进行飞舞[27-30]，波及的响应类型有氧化、复原、水解、酯化、缩合、异构化、重排以及侧链降解等，羟化响应主要位点有C9α、C11α、C11β、C15α、C16α、C16β、C17α、C19、C26，脱氢响应频繁发生在A环的C1, 2和C4, 5位之间，芳醇化响应主要发生在A环上，环氧化响应一般发生在C9, 11和C14, 15位之间，双键复原响应一般发生在A环C1, 2、C4, 5和B环C5, 6位之间，酮基复原主要体现时C3、C17、C20位上，羟基氧化为酮基常见位点C3α、C3β、C17α。甾类化合物飞舞究诘较多的主要体现时羟基化响应、脱氢响应以及侧链降解响应等方面。甾体飞舞微生物包括细菌、放线菌、酵母菌以及霉菌等。化学法除了在甾体C17位比拟容易引入羟基外，其它位点齐很难引入，甾体微生物飞舞中羟化响应是最早用于工业化坐褥的，1952年Murray与Petersons初度讹诈黑根霉一步催化黄体酮为11α-羟基黄体酮，创始了微生物飞舞甾体化合物的前例。少根根霉(R. arrhizus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、赭曲霉(A. orchraceus)、弯孢霉(Curvularia sp.)、小克银汉霉(Cunninghamella sp.)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)也不错催化甾类化合物C11位羟基化[31-32]。对甾体C16α位羟基化飞舞的微生物有玫瑰色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)、绿色链霉菌(S. argenteolus)、橄榄链霉菌(S. olivaceus)、银色链霉菌(S. argenteolus)等[5]。由于抗炎甾体激素药物在母核C1, 2位引入双键后能成倍地增多抗炎作用，微生物脱氢也成为甾体抗炎激素药物合成不可费劲的一步。究诘发现，降解甾类化合物的微生物大多数为Arthrobacter spp.、Brevibacterium spp.、Pseudomonas spp.、Norcardia spp.、Comamonas spp.、Rhodococcus spp.以及Mycobacterium spp.属等[33-59]。大多数在坐褥甾类药物中间体时为了防御核心环降解频繁需要加入遏制剂[1]。部分真菌经过诱变筛选后也不错降解甾醇飞舞要津甾类药物前体物资4-AD[60-61]、9-OHAD[62]和ADD[63-68]。在上述繁多的微生物菌属中，其中红球菌属(Rhodococcus spp.)与分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)偶然有用积聚甾类药物要津中间体4-AD、ADD或9-OHAD，因而引起究诘者的等闲调养。红球菌是介于分枝杆菌与诺卡氏菌之间的一类微生物，与分枝杆菌很相似[69]。红球菌与分枝杆菌用于甾类飞舞坐褥主要基于几个方面本性：(1)多数不具有侵染致病性，且推崇为快速坐褥、易于培养增殖[2]；(2)领有完善的甾类降解基因簇，含有丰富的氧化复原酶以及β-氧化酶系，故意于甾类化合物的快速领悟代谢[70-74]；(3)细胞壁中含有邃密的分枝菌酸层，不错提高细胞的耐受力，适用于甾类的油水两相体系发酵工艺[75]，促进细胞对疏水性甾类化合物的接纳与飞舞[3, 76]。
跟着诱变育种手艺的不休创新以及对微生物降解甾类机制的进一步揭示，究诘者们也曾选育出高效积聚要津甾药前体物资的大量优良菌株[53, 77-81]。近些年来，究诘的重点又转向分枝杆菌属的新金分枝杆菌(Mycolicibacterium neoaurum)[54, 56, 82-90]与耻垢分枝杆菌(Mycolicibacterium smegmatis)[91-95]。
3.2 甾类化合物飞舞微生物生物信息学甾类化合物领悟代谢通路的忖度源自对要津中间体的纵脱基础，因而也导致前期菌种选育方面际遇到瓶颈。跟着基因测序手艺的发展，大多数降解甾醇、胆甾酸、睾酮等甾类的微生物也完成了基因测序[41, 46, 54, 56, 83, 88-90, 93, 96-101]，其中多数为分枝杆菌(表 1)。
在线尺子究诘浮现降解甾类化合物的相关基因频繁成簇陈列且多数基因会由于甾类化合物引导显赫上调，通过比拟红球菌Rhodococcus jostii RHA1与结核分枝杆菌M. tuberculosis H37Rv甾醇代谢基因簇浮现相似性比拟高，且究诘浮现该基因簇受到甾类等底物引导的水平也十分相似[91, 95, 102-104]。基于对红球菌、分枝杆菌等微生物甾类分子降解机制的究诘，学者们缓慢揭示了甾类降解要津基因簇并求教了部分要津基因过火功能[52, 72, 95, 104-111] (图 2)。Griffin通过高密度转座子突变及精湛度测序解释，结核分枝杆菌M. tuberculosis H37Rv与甾醇代谢的基因还有约60%位于上述基因簇以外的其它位置且呈分散现象分散，一些快速滋长型分枝杆菌还因同工酶的存在也给甾类化合物降解机制与工程菌纠正等究诘增多了贫瘠[2, 82, 84, 111-129]。跟着转录组学与卵白组学的发展，部分微生物也进行了甾类化合物引导下的转录组、卵白组以及基因微阵列的测定[74, 91-92, 102-103, 130-132]。
3.3 甾类化合物微生物领悟代谢机制解析频繁甾类化合物如甾醇等在微生物体内领悟代谢历程大约包括4个阶段：(1)甾类化合物的接纳与转运(Uptake and transportation)；(2)底物活化(Substrate activation)；(3)侧链降解(Side-chain degradation)；(4)核心环降解(Core ring cleavage)。甾类化合物在微生物体内领悟代谢历程属于典型的有氧代谢，前期的究诘主如果基于某些代谢中间体忖度可能的代谢蹊径[58, 133-154]。但跟着基因测序以及甾类化合物降解基因簇的揭示，联结核磁共振、高效液相色谱、高效液相-质谱联用、气相色谱以及气相色谱-质谱联用手艺，借助基因工程技能，甾类化合物领悟代谢的要津酶过火功能结构被缓慢纵脱，终了大部分基因与代谢蹊径的准确匹配关联，多步响应机制得以准确求教，从而进一步明确甾类化合物降解机制[2, 27, 45-46, 71-73, 82, 85, 94-95, 102, 105-106, 109-111, 115, 122, 155-175]。字据代谢历程中一些中间体，将代谢旅途及主张大约拟定为4-AD蹊径、ADD蹊径、9-OHAD蹊径、HMP蹊径、HMPD蹊径、9-DHMP蹊径、4-BNC蹊径、1, 4-BNC蹊径、Ts蹊径、BD蹊径[2, 63, 82, 86, 119, 123, 176-179]。以β-Sitosterol和Cholesterol为例，联结基因功能从分子水平探讨甾醇领悟代谢机制(图 3)。
3.3.1 接纳与转运(Uptake and transportation)究诘标明在M. tuberculosis中Mce4驾驭子编码的功能卵白与甾醇转运密切相关，是M. tuberculosis接纳宿主细胞胆固醇的要津系统[180-181]。Mce (Mammalian cell entry)驾驭子存在于Mycobacteriaceae、Nocardiaceae、Intrasporangiaceae、Norcardioidaceae、Pseudonocardiaceae、Streptomycetaceae中，频繁包含2种yrbE基因(yrbEA、yrbEB)与6种mce基因(mceA、mceB、mceC、mceD、mceE、mceF)[182-183]。在M. tuberculosis中存在4套Mce驾驭子[184]，即Mce1、Mce2、Mce3、Mce4，均可编码与ABC转运体(ATP-binding cassette transporters)雷同的跨膜卵白以过火它一些必需的膜表卵白[2, 185]。微生物对甾体底物的主动接纳主要跟Mce4密切相关，这亦然部分致病菌侵染哺乳动物细胞后依靠降解细胞膜内胆固醇而永远寄生的要津[186]。究诘浮现在M. smegmatis中Mce4驾驭子与胆固醇的转运也密切相关[187-188]。究诘发现时Rhodococcus jostii RHA1也存在雷同M. tuberculosis的Mce4功能卵白眷属，受Cholesterol显赫引导，当部分基因或全部基因缺失机菌株无法讹诈Cholesterol、β-Sitosterol、5α-Cholesterol、5α-Cholestanone等物资而滋长，但对4-AD、Progesterone、Cholic acid等甾类物资的讹诈实在无影响，Mce4编码的转运子仅能识别C17取代有至少8个碳原子的非极性类基团如胆固醇等物资[2, 104, 185]。
3.3.2 底物活化(Substrate activation)甾醇底物活化主要包括3个阶段(图 3A)：
第一阶段：甾醇起初氧化为胆甾-5-烯-3-酮(5-Cholesten-3-one)，然后异构化为胆甾-4-烯-3-酮(4-Cholesten-3-one)，这一步主要由胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase，ChO)催化完成。ChO为寡聚黄素氧化酶，以FAD为辅基，可同期催化甾醇C3位的羟基氧化脱氢与C5位向C4位的异构化，包括GMC (Glucose-methanol-choline，与FAD非共价联结)和BOC2 (与FAD共价联结)两大类。不同起头的胆固醇氧化酶均不错催化多种3β-羟基底物，上述两大类ChO对底物能源学和氧化复原才智互异性比拟显赫。究诘浮现ChO除上述功能外还不错催化胆固醇生成6β-羟基-胆甾-4-烯-3-酮[2, 189-191]。在M. neoaurum ATCC 25795基因组中存在两种类型的ChoM1与ChoM2，ChoM2固然位于kstR (TetR-type transcriptional regulator)调控区外但属于胞外分泌型，是参与氧化脱氢与异构化这一阶段的要津酶，而ChoM1位于kstR调控区内，与膜联结起支持作用[2]。关联词，在M. tuberculosis与M. smegmatis等微生物中催化这一阶段的要津酶并不是ChO，而是由另一类甾类脱氢酶3β-Hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD)，以雷同NAD或者NADP为辅基，该类卵白眷属宽阔存在一段甘氨酸密集区(GX2GX2G)与活性中心(YX2K)，固然位于降解甾醇基因簇以外，却受到kstR转录因子的调控[111, 192-193]。姚抗发现时M. neoaurum ATCC 25795基因组中也存在一种3β-HSD，但阐明不是甾醇代谢所必需的酶[2]。除了上述的ChO与3β-HSD具有C5位向C4位异构化功能外，在Mycobacterium、Pseudomonas putida、Comamonas testosteroni等菌中还存在另一类甾酮异构酶Δ5-3-Ketosteroid isomerase (KSI)，也不错告成催化胆甾-5-烯-3-酮向胆甾-4-烯-3-酮飞舞[194-204]，部分分枝杆菌还存在多种同工酶，分析忖度可能在异构化这一步起协助催化作用。
第二阶段：胆甾-4-烯-3-酮C27羟基化再氧化成甾醛(3-Oxo-4-cholestene-25-carbaldehyde)，临了氧化为甾酸(3-Oxo-4-cholestene-27-oic acid)，这是初始侧链降解的要津第一步。这一阶段主要由Cytochrome P450催化完成，主要包括Cyp125与Cyp142，存在于M. tuberculosis、M. smegmatis，两者催化位点在C27位，但Cyp125催化产生25S羟化构型家具，而Cyp142产生25R羟化构型家具[74, 107, 126, 205-208]。关联词Rhodococcus jostii RHA1[54, 106]与Mycobacterium bovis BCG[209]的Cyp125却主要催化C26羟基化。Su等究诘M. neoaurum TCCC 11978发现有在3种Cyp125，其中Cyp125-1位于kstR调治区igr因子，过抒发引起ADD(D)产率晋升[84]，通过同源性以及堤防比对分析M. neoaurum ATCC 25795基因组也发现有在3种Cyp125。
第三阶段：甾酸在乙酰辅酶A合成酶(Acyl-CoA synthetase)下发生转乙酰作用而被活化，侧链进一步进行雷同脂肪酸的β-氧化(β-Oxidation)历程，与这一步催化响应相关的酶为FadD19 (Steroid-26-oyl-CoA synthetase)，位于kstR调控区[102]。Yang等[166]阐明FadD19不错催化3-Oxo-cholest-4-ene-26-oic acid飞舞为3-Oxo-cholest-4-ene-26-oyl CoA，但Wilbrink等[210]在RG32究诘中发现敲除fadD19基因后不影响胆固醇的侧链降解，但不错阻断含有C24支链的菜油甾醇与β-谷甾醇的侧链降解，与Wrońska等究诘M. smegmatis MC2 155论断基本一致[171]。姚抗究诘M. neoaurum ATCC 25795敲除kshA-fadD19-echA19后发现对植物甾醇飞舞收尾欠安，但不影响胆固醇代谢[2]。固然Cyp125产生25S构型甾酸家具，Cyp142产生25R构型甾酸家具，究诘浮现M. tuberculosis H37Rv的FadD19对构型莫得采选性，不错同期催化这两种构型家具[128, 166]。可推断FadD19是植物甾醇降解的要津酶，而不是胆固醇代谢的限速因子，因此可能还存在其它催化该神气的同工酶FadD36[111]，植物甾醇和胆固醇互异性体现时C24存在支链，可知FadD19应该是一个多功能酶。
3.3.3 侧链降解(Side-chain degradation)胆固醇的侧链降解雷同于脂肪酸的β-氧化(β-Oxidation)历程，共进行三轮氧化历程，前两轮基本上与β-氧化一致，临了一轮脱丙酰辅酶A (Propionyl CoA)属于反醇醛响应，此轮响应不同于脂肪酸的β-氧化而有显赫互异性，经过三轮氧化胆固醇循序开释出各1分子丙酰辅酶A (Propionyl CoA)、乙酰辅酶A (Acetyl CoA)和丙酰辅酶A (Propionyl CoA)，而β-谷甾醇发生氧化作用则循序开释出2分子丙酰辅酶A (Propionyl CoA)、1分子乙酰辅酶A (Acetyl CoA)、1分子丙酰辅酶A (Propionyl CoA) (图 3B)。脂肪酸的β-氧化酶系包括FadD family (Fatty-acid-CoA ligase)、FadE family (Acyl-CoA dehydrogenase)、EchA family (Enoyl-CoA hydratase)、FadB family (β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)、FadA family (Acetoscetyl-CoA thiolase)。由3.3.1所述可知FadD19参与了第一步活化响应，因而鼓励了后续催化响应。
第一轮脱氢酶为FadE26-FadE27 (ChsE4-ChsE5)，第二轮脱氢酶为FadE28 (ChsE3)，第三轮脱氢酶为FadE28-FadE29 (ChsE1-ChsE2)，全部位于kstR调控区[2, 46, 71-72, 102, 110, 166, 175, 211]。Yang等究诘M. tuberculosis H37Rv标明ChsE4-ChsE5对第一步26-OCS-CoA的脱氢响应活力最强，ChsE3专一性催化第二步3-OCO-CoA的脱氢响应，而ChsE1-ChsE2专一性催化3-OPC-CoA的脱氢响应，此外ChsE4-ChsE5也不错催化3-OCO-CoA与3-OPDC-CoA的脱氢响应，对ChsE3与ChsE1-ChsE2起到一定的协助作用[166]。而Wilbrink等究诘发现RG32敲除fadE26-fadE27后对菜油甾醇失去降解才智，而对β-谷甾醇与胆固醇降解实在莫得影响[210]。相似情况也发生在M. neoaurum ATCC 25795中，敲除fadE26-fadE27后对主家具4-AD与ADD影响比拟少，只是不再积聚宝丹酮(Boldenone，BD)与睾酮(Testerone，Ts)[2]。固然M. tuberculosis H37Rv的FadD19对C27甾酸构型莫得采选性，关联词ChsE4-ChsE5却只专一性催化25S构型家具，而25R构型家具需要在α-Methyl acyl CoA (MCR)异构酶飞舞为25S构型才智被进一步降解[128]。FadE26-FadE27并非显赫述用于β-谷甾醇与胆固醇侧链降解，也可能还存在其它同工酶FadE5或FadE25阐扬相关作用[111]。ChsE1-ChsE2催化3-OPC-CoA为3-OPDC-CoA也得到了阐明[166, 170, 175]。
Yang等阐明ChsH1-ChsH2不错催化3-OPDC-CoA为17-BHOPC-CoA[175]。Wrońska等究诘发现M. smegmatis MC2 155敲除echA19基因后对β-谷甾醇与胆固醇降解实在无影响[171]，这与姚抗究诘M. neoaurum ATCC 25795的论断一致[2]。综上可知，对于甾醇侧链降解前两步催化Enoyl-CoA hydratase相关酶如EchA9[111]还有待进一步深切究诘。
在M. tuberculosis H37Rv基因组中β-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase共有5种(FadB1、FadB2、FadB3、FadB4、FadB5)[101, 110]。Taylor等究诘发现当敲除fadB2基因后实在无影响[212]。罢休现时，分枝杆菌第一个氧化历程催化β-羟基飞舞为酮基的β-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase尚未报谈。姚抗究诘M. neoaurum ATCC 25795时阐明Hsd4A是第二轮氧化中催化22-HOCO-CoA为22-DOCO-CoA的要津酶，敲除该基因后C22中间体β-氧化代谢统统被遏制，转向新的旁路代谢蹊径HMP蹊径而生成HMPD，此外该酶还具有C17-β-羟基氧化作用，为双功能酶[2, 165]。
Nesbitt等究诘发现M. tuberculosis H37Rv的FadA5具有Thiolase功能，它是飞舞胆固醇为4-AD与ADD家具的要津酶[172]。姚抗究诘发现当敲除M. neoaurum ATCC 25795的fadA5基因后植物甾醇代谢历程不再积聚4-AD与ADD家具，反而大量积聚HMPD，应该是转向旁路代谢蹊径HMP蹊径所致，阐明发生β-氧化的4-AD蹊径与ADD蹊径统统被遏制[2]。Schaefer等阐明M. tuberculosis H37Rv的FadA5具有催化22-DOCO-CoA为3-OPC-CoA的功能，忖度可能也具有催化27-DOCS-CoA为3-OCO-CoA的功能，也便是第一轮β-氧化的临了一步[173]。第三轮β-氧化临了一步则由醛缩酶Ltp2完成，ltp2属于igr驾驭子，姚抗究诘发现当敲除M. neoaurum ATCC 25795的ltp2基因后代谢家具发生显赫变化，不再积聚4-AD与ADD家具，而出现未见报谈的6种复杂物资，但由于莫得分离出单体物资而无法表征[2]。Gilbert等阐明Ltp2不错飞舞17-BHOPC-CoA为4-AD家具，阐明M. tuberculosis H37Rv的Ltp2协同ChsH2酿成复合体阐扬最大催化作用，在生物体内可能酿成Ltp2-ChsH2-ChsH1复合体发生作用[170]。
β-谷甾醇发生氧化作用与胆固醇氧化作用互异性源于C24存在乙基支链，在第一轮脱氢后并非告成发生水协作用，而是C28位起初发生羧化作用，这一步由Methyl-crotonyl-CoA carboxylase催化完成，该酶受到β-Sitosterol严格引导，而Cholesterol则不行引导[148]。接着由Ltp3-Ltp4发生反醛醇响应脱去1分子丙酰辅酶A，Wilbrink等在究诘RG32时阐明Ltp3-Ltp4是催化含有C24支链β-Sitosterol与Campesterol等降解的要津酶系，具有醛缩酶功能[129]，而姚抗究诘发现当敲除M. neoaurum ATCC 25795的ltp3-ltp4基因后植物甾醇代谢仍旧积聚4-AD与ADD家具，与野生型基本一致，阐明在该菌中Ltp3-Ltp4并非是植物甾醇降解的要津酶系，可能还存在其它同工酶作用，可能是侧链降解的要津酶系[2]。
说七说八，经过侧链降解后，1分子胆固醇不错产生2分子丙酰辅酶A和1分子乙酰辅酶A，而1分子β-谷甾醇则不错产生3分子丙酰辅酶A和1分子乙酰辅酶A，丙酰辅酶A与乙酰辅酶A临了会干与TCA (Tricarboxylic acid cycle)轮回进一步氧化领悟。有究诘者估算1分子的胆固醇经过氧化临了可得7分子的FADH2和18分子的NADH，至少产生80单元的ATP[148]。
3.3.4 核心环降解(Core ring cleavage)核心环降解代谢(图 3C)是3-甾酮-Δ1-脱氢酶(3-Ketosteroid-Δ1-dehydrogenase，KstD)与3-甾酮-9α-羟化酶(3-Ketosteroid-9α-hydroxylase，KSH)共同作用引起的，KstD使A环的C1(2)发生脱氢作用，而KSH则是使B环C9发生羟基化作用，从而产生9α-羟基-1, 4-二烯甾体的不安稳结构，由于过高的分子势能自觉激勉B环C9(10)开环裂解，频繁称为9, 10-开环降解蹊径(9, 10-sec-pathway)。因此KstD与KSH成为进击甾药化合物筛选需要筹商的要津酶，KstD的失活或缺失不错通过发酵富集制备9-OHAD、9-DHMP、4-BNC以及Ts等，而KSH的失活或缺失不错通过发酵富集制备ADD、HMPD、1, 4-BNC以及BD等，当KstD与KSH两者同期缺失或失活时不错制备4-AD、HMP等。关联词不同微生物中KstD与KSH的种类与功能存在较大的互异性，对底物的采选性有显赫性互异，在生物体内是否受甾类物资引导也存在昭着不同。不同微生物的KstD与KSH可能存在多种同工酶基因。究诘标明，KstD多数为寡聚膜卵白，结构中存在穿膜螺旋区，以黄素卵白FAD为辅酶，在N端存在高度保守的GSG(A/G)(A/G)(A/G)X17E联结区，该酶经纯化后未检测到活性，可能原因在于该酶的功能与细胞膜的生理现象密切相关[2, 169]。Rohman等从结构忖度出KstD的催化机制为Tyr487的羟基和Gly491的酰胺键与底物C3的羰基作用导致底物C3酮式-烯醇式互变异构，Tyr318与Tyr119通过氢键作用夺取C2的β-氢质子而C2变成碳负离子，当负电荷转换到C1时，FAD的异咯嗪环N5原子夺取C1的α-氢，此时在C1与C2之间酿成双键[169]。KSH属于Class Ⅳ型单加氧酶，由结尾加氧酶(KshA)与铁流复原酶(KshB)双组分组成，KshB存在3处参与电子传递的高度保守功能区，即RCYSL为FAD联结区，GSGITP为NAD联结区，CX4CX2CX29C为电子传递性铁流卵白[2, 213]。KSH羟基化响应源于NADH的氧化，目田电子通过KshB辅酶FAD传递到铁流复原中心，过渡到KshA的Rieske结构域，临了在KshA活性中心Fe2+处联结氧分子，从而完成C9-α位的羟基化响应[2, 122, 162]。
在Rhodococcus erythropolis SQ1中发现永诀存在两种KstD[214-215]与KSH[117, 122]。大多数微生物一般只含有一种KshB组分，部分微生物可能存在多种KshB组分[54, 105]，现时大多数究诘主要辘集在KshA组分过火功能与结构的究诘，而对KshB组分、功能与结构究诘较少，此外也有究诘标明KshB组分甾体C26-羟基化密切相关[122, 216]。魏巍在M. neoaurum NwIB-01中发现各存在1种KstD、KshA及KshB，KstD对4-AD催化效用较高，敲除或者使KSH失活会导致ADD产量增多[7, 217-219]。而在M. tuberculosis H37Rv基因组中也仅存在1种KstD、KshA及KshB，固然KstD不行催化4-AD飞舞为ADD[123]，但KstD与KSH催化要津中间4-BNC与4-BNC-CoA推崇出较高酶活性[176, 220]，相似在HGMS2中也发现仅存在1种KstD[221]。在M. neoaurum ATCC 25795中存在3种KstD与2种KshA及1种KshB[2, 179]，MN-KstD1显赫受甾醇与9OHAD底物引导，而MN-KstD3受4-AD显赫引导，MN-KstD2则引导作用不昭着，忖度MN-KstD1是9-OHAD蹊径要津脱氢酶，MN-KstD3则是参与4-AD蹊径起到协助降解甾醇作用，MN-KstD1对9-OHAD体现出高催化活性，而MN-KstD3对4-AD具有高催化才智；MN-KshA1受到甾醇底物的显赫引导，MN-KshA2B催化才智总体较弱，而MN-KshA1B对4-BNC与1, 4-BNC推崇出高催化才智，其次为ADD，而对4-AD催化作用较弱。在M. neoaurum DSM1381中存在3种KstD，其中KstD1受植物甾醇的显赫引导对HMP催化作用强，而KstD2对4-AD催化才智较HMP强[82]。在Rhodococcus ruber Chol-4中存在3种KstD[119]与3种KshA及1种KshB[114]，KstD1对9OHAD与Ts具有高催化才智，KstD2则对Ts与Deoxycorticosterone (DOC)浮现高活性，而KstD3只是体现时5α-Ts；KshA2对含有短支链的甾类底物催化才智强，KshA3则对长支链甾醇底物体现出高活力，KshA1可能与胆甾酸代谢相关。在Rhodococcus rhodochrous DSM 43269中存在3种KstD[120]与5种KshA及2种KshB[116]，KstD1是导致9-OHAD降解的主要原因，其次是KstD2，而KstD3无催化作用；5种KshA同工酶浮现馅毫不疏导的底物本性，各自具有特定的底物引导机制。9-OHAD高产菌种M. neoaurum VKM Ac-1817D中也存在5种KstD与5种KshA组分及2种KshB组分，不错看出5种同工酶KstD对4-AD与9OHAD催化才智很弱，KSH催化4-AD的才智可能相对较强，不错催化Ts为9OH-Ts，也不错催化HMP为9-DHMP[54-55, 87, 222-223]。在4-AD高产菌种M. neoaurum VKM Ac-1815D中仅存在1种KstD与2种KshA及2种KshB组分，标明KstD对4-AD、9-OHAD、HMP催化才智很弱，KSH催化4-AD的才智也可能比拟弱[53-54, 90, 222, 224]。在ADD高产菌种M. neoaurum VKM Ac-1816D中仅存在1种KstD与2种KshA及2种KshB组分，标明KstD对4-AD催化才智很强，且同期也不错催化HMP为HMPD，而KSH催化4-AD的才智也可能比拟弱[54, 222]。
KstD与KSH是核心环降解的两个要津酶，现时一致认同的是9-OHADD自觉发生B环C9(10)位断链为3-HSA，然后在M. tuberculosis的Hsa眷属卵白HsaA/B、HsaC、HsaD或者是C. testosteroni的Tes眷属卵白TesA1/2、TesB、TesD催化降解为HHD (原A环结构)与DOHNAA，HHD在M. tuberculosis的HsaE、HsaF、HsaG或者是C. testosteroni的TesE、TesG、TesF进一步降解为丙酰辅酶A与丙酮酸，而DOHNAA在FadD3、IpdF、FadE30、FadE33、FadE31-32、IpdC、IpdA/B、FadA6、EchA20等酶系进一步飞舞为丙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A (Succinyl-CoA)[45, 73, 95, 104, 157-161, 225-228]。Capyk等究诘发现胆固醇环降解酶系对含有支链的侧链代谢家具(如9-HBNCD，9-Hydroxy-3-oxo- 23, 24-bisnorchola-1, 4-diene-20-oic acid；9-HOPDC- CoA，9-Hroxy-3-oxo-pregna-1, 4-diene-20-carboxyl-CoA)的活力要高于侧链统统降解家具(如4-AD)[176]。另外，Rhodococcus spp.在胆甾酸降解中存在雷同中间体降解开环蹊径[229-230]。此外，也有究诘标明甾醇侧链降解与核心环部分降解实在同期进行[176]，这亦然导致部分要津甾药中间体摩尔收率下落的主要原因。
在Steroidobacter denitrificans究诘中发现还存在2, 3-开环降解蹊径(2, 3-sec-pathway)，Yang等[155]究诘该菌降解雄性激素(睾酮)发生2, 3-开环降解蹊径(图 4A)，Wang等[156]在究诘该菌降解胆固醇代谢时也发现发生了2, 3-开环降解蹊径(图 4B)。
说七说八，1分子的胆固醇经过统统降解后将产生4分子丙酰辅酶A、4分子乙酰辅酶A、1分子丙酮酸和1分子琥珀酰辅酶A，而1分子的β-谷甾醇经过统统降解后将产生5分子丙酰辅酶A、4分子乙酰辅酶A、1分子丙酮酸和1分子琥珀酰辅酶A，丙酰辅酶A、乙酰辅酶A与琥珀酰辅酶A临了干与TCA轮回发生透顶氧化，产生大量的FADH2、NADH以及ATP。
4 瞻望微生物在甾类化合物飞舞历程中阐扬了进击的作用，将先进的生物制造理念引进甾体药物坐褥工业，从而提高资源讹诈率，降呆板耗，终了绿色制造可捏续发展。因此，基于基因组学、卵白组学以及转录组学进一步揭示要津酶系过火催化机理不仅具有进击的表面意旨，何况具有进击的产业化价值。一方面，在已有的究诘基础上进一步究诘并探明甾类降解微生物领悟代谢HMP蹊径、4-AD蹊径、ADD蹊径、9-OHAD蹊径、HMP蹊径等要津酶系及分流机制，借助基因工程技能，通过基因敲除构建新式甾药中间体坐褥工程菌，终了4-AD、ADD、9-OHAD、DHEA、HMP等甾药要津中间体单一家具的坐褥，提高飞舞率的同期终了破解家具分离纯化瓶颈难题，实在统统的甾类激素药物齐不错基于4-AD或ADD为原料合成，开发酶法或化学法新式制备工艺。另一方面，基于对已有飞舞微生物或者酶系缚构功能的究诘，通过转录组学与卵白组学测定分析获取微生物飞舞酶基因序列并克隆构建新式工程菌抒发体系，进一步接收基因突变手艺筛选高催化活性酶，借助酶工程手艺终了酶法飞舞甾体药物真人性交图片，完成化学合成法不行完成的响应，以及克服化学合成法的区域与立体采选性不及，拓展KstD、KSH、C11/16/17位羟化酶等甾药飞舞酶系的应用究诘，用于坐褥甾药活性因素(Active pharmaceutical ingredients，APIs)如Testosterone、Boldenone、Dexamethasone等，克服微生物细胞水平飞舞副家具的生成，提高甾药活性的同期幸免化学法无益试剂残留对东谈主体的危害。